大屏幕分光光度計已經(jīng)成為現(xiàn)代分子生物實驗室常規(guī)儀器。常用于核酸，蛋白定量以及細菌生長濃度的定量。儀器主要由光源、單色器、樣品室、檢測器、信號處理器和顯示與存儲系統(tǒng)組成。
1、分光光度計原理
大屏幕分光光度計采用一個可以產(chǎn)生多個波長的光源，通過系列分光裝置，從而產(chǎn)生特定波長的光源，光線透過測試的樣品后，部分光線被吸收，計算樣品的吸光值，從而轉(zhuǎn)化成樣品的濃度。樣品的吸光值與樣品的濃度成正比。
單色光輻射穿過被測物質(zhì)溶液時，被該物質(zhì)吸收的量與該物質(zhì)的濃度和液層的厚度(光路長度)成正比，其關(guān)系為:A=-lg(I/I。)=-lgT=kLc 式中:A 為吸光度;I。為入射的單色光強度;I 為透射的單色光強度;T 為物質(zhì)的透射率;k 為摩爾吸收系數(shù);L 為被分析物質(zhì)的光程，即比色皿的邊長;c為物質(zhì)的濃度;
物質(zhì)對光的選擇性吸收波長，以及相應(yīng)的吸收系數(shù)是該物質(zhì)的物理常數(shù)。當(dāng)已知某純物質(zhì)在一定條件下的吸收系數(shù)后可用同樣條件將該供試品配成溶液，測定其吸收度,即可由上式計算出供試品中該物質(zhì)的含量。在可見光區(qū)，除某些物質(zhì)對光有吸收外，很多物質(zhì)本身并沒有吸收但可在一定條件下加入顯色試劑或經(jīng)過處理使其顯色后再測定,故又稱比色分析。由于顯色時影響呈色深淺的因素較多，且常使用單色光純度較差的儀器，故測定時應(yīng)用標準品或?qū)φ掌吠瑫r操作。
2、大屏幕分光光度計使用方法步驟
1)預(yù)熱儀器。為使測定穩(wěn)定，將電源開關(guān)打開，使儀器預(yù)熱20min，為了防止光電管疲勞，不要連續(xù)光照。預(yù)熱儀器時和在不測定時應(yīng)將比色皿暗箱蓋打開，使光路切斷。
2)選定波長。根據(jù)要求，轉(zhuǎn)動波長調(diào)節(jié)器，使指針指示所需要的單色光波長。
3)固定靈敏度檔。根據(jù)有色溶液對光的吸收情況，為使吸光度讀數(shù)為0.2-0.7，選擇合適的靈敏度。為此，旋動靈敏度檔，使其固定于某一檔，在實驗過程中不再變動。一般測量固定在“1”檔。
4)調(diào)節(jié)“0”點。輕輕旋動調(diào)“0”電位器，使讀數(shù)表頭指針恰好位于透光度為“0”處(此時，比色皿暗箱蓋是打開的，光路被切斷，光電管不受光照)。
5)調(diào)節(jié)T=。將盛蒸餾水(或空白溶液或純?nèi)軇?的比色皿放入比色皿座架中的*格內(nèi)，有色溶液放在其它格內(nèi)，把比色皿暗箱蓋子輕輕蓋上，轉(zhuǎn)動光量調(diào)節(jié)器，使透光度T=，即表頭指針恰好指在T=處。
6)測定。輕輕拉動比色皿座架拉桿，使有色溶液進入光路，此時表頭指針所示為該有色溶液的吸光度A。讀數(shù)后，打開比色皿暗箱蓋。
7)關(guān)機。實驗完畢，切斷電源，將比色皿取出洗凈，并將比色皿座架及暗箱用軟紙擦凈。
3、主要項目對分析結(jié)果的影響
1)波長準確度
分光光度法原理要求照射在樣品池上的單色光必須對應(yīng)于樣品吸收光譜中的某一個吸收峰的波長。由于儀器的制造和調(diào)整誤差，單色光的實際波長與儀器的波長讀數(shù)值間都存在一定的誤差。樣品中絕大部分的主要吸收峰都有一定的寬度，對波長準確度要求允許寬些。但是，當(dāng)吸收峰寬度較小，而且吸收峰兩側(cè)邊緣比較陡直，此時波長準確度的影響就必須引起注意。
2)透射比(吸光度)準確度
很顯然,透射比或吸光度的誤差越大,測試結(jié)果的可信性越差,從而影響到測試數(shù)據(jù)的準確性。
3)雜散光
雜散光是由于光學(xué)元件制造誤差以及光學(xué)和機械零件表面的漫反射形成的。雜散光是分析樣品的非吸收光，隨著樣品濃度的增加，雜散光的影響也隨之增大，將給分析結(jié)果帶來一定的誤差。在紫外的短波區(qū)域光源強度和檢測器的靈敏度均明顯減弱，雜散光的影響更不能忽視。因此，雜散光的大小也是儀器性能的一項重要指標。
4、使用與維護
1)若大幅度改變測試波長，需稍等片刻，等燈熱平衡后，重新校正“0”和“”點。然后再測量。
2)指針式儀器在未接通電源時，電表的指針必須位于零刻度上。若不是這種情況，需進行機械調(diào)零。
3)比色皿使用完畢后，請立即用蒸餾水沖洗干凈，并用干凈柔軟的紗布將水跡擦去，以防止表面光潔度被破壞，影響比色皿的透光率。
4)操作人員不應(yīng)輕易動燈泡及反光鏡燈，以免影響光效率。
5)WFZ800-DA、756型等分光光度計，由于其光電接收裝置為光電倍增管，它本身的特點是放大倍數(shù)大，因而可以用于檢測微弱光電信號，而不能用來檢測強光。否則容易產(chǎn)生信號漂移，靈敏度下降。針對其上述特點，在維修、使用此類儀器時應(yīng)注意不讓光電倍增管長時間暴露于光下，因此在預(yù)熱時，應(yīng)打開比色皿蓋或使用擋光桿，避免長時間照射使其性能漂移而導(dǎo)致工作不穩(wěn)。
6)放大器靈敏度換擋后，必須重新調(diào)零。
7)比色杯的配套性問題。比色杯必須配套使用，否則將使測試結(jié)果失去意義。在進行每次測試前均應(yīng)進行比較。具體方法如下;分別向被測的兩只杯子里注入同樣的溶液，把儀器置于某一波長處，石英比色杯;220nm、700nm裝蒸餾水，玻璃比色杯：700nm處裝蒸餾水，將某一個池的透射比值調(diào)至，測量其他各池的透射比值，記錄其示值之差及通光方向，如透射比之差在±0.5%的范圍內(nèi)則可以配套使用，若超出此范圍應(yīng)考慮其對測試結(jié)果的影響。
5、大屏幕分光光度計操作使用過程中的注意事項
1)為了防止光電管疲勞。不測定時必須將比色皿暗箱蓋打開，使光路切斷，以延長光電管使用壽命。
2)比色皿的使用方法：
?、倌帽壬髸r，手指只能捏住比色皿的毛玻璃面，不要碰比色皿的透光面，以免沾污。
?、谇逑幢壬髸r，一般先用水沖洗，再用蒸餾水洗凈。如比色皿被有機物沾污，可用鹽酸-乙醇混合洗滌液(1∶2)浸泡片刻，再用水沖洗。不能用堿溶液或氧化性強的洗滌液洗比色皿，以免損壞。也不能用毛刷清洗比色皿，以免損傷它的透光面。
每次做完實驗時，應(yīng)立即洗凈比色皿。
?、郾壬笸獗诘乃貌羚R紙或細軟的吸水紙吸干，以保護透光面。
?、軠y定有色溶液吸光度時，一定要用有色溶液洗比色皿內(nèi)壁幾次，以免改變有色溶液的濃度。另外，在測定一系列溶液的吸光度時，通常都按由稀到濃的順序測定，以減小測量誤差。
?、菰趯嶋H分析工作中，通常根據(jù)溶液濃度的不同，選用液槽厚度不同的比色皿，使溶液的吸光度控制在0.2～0.7。
6、大屏幕分光光度計操作中容易出現(xiàn)的幾個典型故障及其排除方法
1)儀器不能調(diào)零?？赡茉?
?、俟忾T不能*關(guān)閉。解決方法:修復(fù)光門部件，使其*關(guān)閉。
?、谕高^率""旋到底了。解決方法:重新調(diào)整""旋鈕。
③儀器嚴重受潮。解決方法:可打開光電管暗盒，用電吹風(fēng)吹上一會兒使其干燥，并更換干燥劑。
?、茈娐饭收?。解決方法:送修理部門，檢修電路。
2)儀器不能調(diào)""?？赡茉?
?、俟饽芰坎粔颉＝鉀Q方法:增加靈敏度倍率檔位，或更換光源燈(盡管燈還亮)。
?、诒壬蠹芪绰湮?。解決方法:調(diào)整比色皿架使其落位。
③光電轉(zhuǎn)換部分老化。解決方法:更換部件。
?、茈娐饭收?。解決方法:調(diào)修電路。
3) 測量過程中,""點經(jīng)常變動?？赡茉?
?、俦壬笤诒壬蠹苤蟹胖玫奈恢貌灰恢?，或其表面有液滴。解決方法:用擦鏡紙擦干凈比色皿表面，然后將其安放在比色槽的左邊，上面用定位夾定位。
?、陔娐饭收?電壓、光電接收、放大電路)。解決方法:送修。
4)數(shù)顯不穩(wěn)?？赡茉?
①預(yù)熱時間不夠。解決方法:延長預(yù)熱時間至30分鐘左右(部分儀器由于老化等原因，長時間處于工作狀態(tài)時，也會工作不穩(wěn))。
?、诠怆姽軆?nèi)的干燥劑失效，使微電流放大器受潮。解決方法:烘烤電路，并更換或烘烤干燥劑。
?、郗h(huán)境振動過大、光源附近空氣流速大、外界強光照射等。解決方法:改善工作環(huán)境。
?、芄怆姽?、電路等其它原因。解決方法:送修。
全國服務(wù)熱線：
網(wǎng)站首頁 ◇ 新聞資訊 ◇ 析譜儀器大屏幕分光光度計使用的工作原理分析簡述
